|
|
Příprava a purifikace plasmidových DNA
Němeček, Milan ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
S rozvojem terapeutických metod v lékařství, jako jsou DNA vakcíny a genová terapie, se zvyšuje poptávka po nových postupech izolace a purifikace vysoce čisté plazmidové DNA. Nejčastěji využívanými metodami purifikace plazmidové DNA jsou metody chromatografické. V experimentální části byla provedena izolace plazmidové DNA pUC 19 metodou alkalické lýze. A následně byla provedena purifikace plazmidové DNA agarózovou gelovou elektroforézou a kapalinovou chromatografií.
|
|
|
Depozice pomocí fokusovaného elektronového svazku
Juřík, Karel ; Zmeškal, Oldřich (oponent) ; Pospíšil, Jan (vedoucí práce)
V rámci této práce byla provedena série depozic pomocí fokusovaného elektronového svazku z trimethyl(methylcyklopentadienyl)platičitého komplexu v prostředí vodních par. Byla sledována závislost čistoty připravených materiálů na urychlovacím napětí svazku a tlaku vodních par. Bylo dosaženo maximálního obsahu platiny (27,2 ± 0,4) at. % (při urychlovacím napětí 5 kV, proudu svazku 1600 pA a tlaku vodních par 100 Pa). Po následném dlouhodobém vystavení atmosférickým vlivům (světlu, vzdušné vlhkosti a kyslíku) tato hodnota vzrostla až na konečných (39,2 ± 2,1) at. %.
|
|
|
Produkce polyhydroxyalkanoátů s využitím odpadních substrátů a jejich následná izolace
Grossová, Marie ; Babák, Libor (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Cílem práce je studium možností mikrobiální produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA) na různých odpadních substrátech. Polyhydroxyalkanoáty nacházejí uplatnění jako biodegradabilní materiály. Pro laboratorní práci byla využita průmyslově užívaná bakterie Cupriavidus necator, jež byla kultivována s prekurzory různých monomerních jednotek s cílem produkce kopolymerů 3HB s 3HV a 4HB. Bakterie byla dále kultivována na různých odpadních substrátech, především olejnatých, s cílem dosáhnout co nejvyšší produkce polymeru. Další velkou část práce tvoří studium izolačních strategií PHA s využitím enzymů. Komerčně využívané protéazy – alkaláza a pankreatin – jsou účinnými enzymy pro rozklad bakteriální buňky. Řada optimalizačních experimentů ukázala, že při použití enzymu můžeme získat až o 13 % čistší polymer. Vzrůst čistoty PHA až nad 90% hranici byl docílen přídavkem povrchově aktivní látky, která podporuje rozpustnost buněčných komponent netvořících polymer a může zvýšit čistotu až o 20 % vůči kontrolní kultivaci. Část práce se zabývá i využitím enzymového preparátu izolovaného z bakterie Bacillus subtilis. Jeho aplikace na bakteriální kultury vedla k zisku polymeru s čistotou přesahující 95% hranici. Tyto výsledky by mohly být základem nové izolační strategie, která povede k efektivnějšímu zisku PHA z biomasy.
|
|
|
Aplikace pro zpracování dat z oblasti genového inženýrství
Brychta, Jan ; Burgetová, Ivana (oponent) ; Očenášek, Pavel (vedoucí práce)
Tato práce má několik cílů. Jedním z nich je seznámit s problematikou genového inženýrství, zejména pak s fragmentací DNA, makromolekulou DNA, metodami pro purifikaci a separaci nukleových kyselin, enzymy používanými k úpravám těchto kyselin, amplifikací a také seznámit se shlukovou a gradientovou analýzou. Dalším cílem je pak prostudovat existující nástroj a srovnat ho s návrhem vlastní aplikace, což si klade jako cíl třetí. S návrhem úzce souvisí poslední z cílů. Je jím samotná implementace a zápis, jak byla aplikace otestována s reálnými daty. Získané výsledky budou diskutovány, stejně jako možnosti dalšího rozšíření.
|
|
|
Nukleové kyseliny jako terapeutické agens
Ráčková, Lucie ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
S rozvojem molekulární biologie dochází i k rozvoji v onkoterapii. Hlavním směrem moderní medicíny je genová terapie. V genové terapii jsou používány dvě kategorie vektorů, a to virové vektory a nevirové vektory. K nevirovým vektorům patří plazmidy. Plazmidová DNA využívána v medicíně musí být dokonale čistá. V současnosti jsou k izolaci a purifikaci plazmidové DNA využívány hlavně chromatografické metody. Výzkum a vývoj se ale zabývá i jinými metodami, například dvoufázovými vodnými systémy a magnetickými nosiči. V experimentální části byla provedena izolace plazmidové pUC 19 DNA z kultury buněk Escherichia coli JM 109 (pUC 19) metodou alkalické lýze. Izolovaná plazmidová DNA byla purifikovaná pomocí třech metod: RNA v plazmidové DNA byla vysrážena chloridem lithným, RNA byla degradovaná imobilizovanou RNázou A a plazmidová DNA byla purifikována pomocí dvoufázového systému. Kvalita izolované plazmidové DNA byla ověřena spektrofotomericky a agarózovou gelovou elektroforézou.
|
|
|
Purifikace rekombinantních proteinů pomocí afinitní chromatografie
Zemek, Ondřej ; Mácha, Jaroslav (vedoucí práce) ; Hrdý, Ivan (oponent)
Izolace a purifikace rekombinantních proteinů je základním předpokladem pro studium jejich strukturních a funkčních vlastností. Mezi nejdůležitější metody, které jsou k tomuto účelu využívány patří afinitní chromatografie. V této práci jsou shrnuty v literatuře publikované vlastnosti a zkušenosti s využitím nejpoužívanějších afinitních tagů. Zde probrané tagy zahrnují:CBP, MBP, GST, polyhistidinové a polyargininové tagy, FLAG-tag, Strep-tag II a SpA a některé jejich modifikace. U jednotlivých tagů je probrán jejich původ a vlastnosti, vliv na formu a lokalizaci fúzního proteinu, způsob jeho vazby a eluce ze substrátu a možnosti jeho odstranění nebo využití v jiných metodách. Klíčová slova: afinitní chromatografie, rekombinantní protein, purifikace, afinitní tag
|
|
|
Charakterizace rekombinantního fragmentu protilátky proti znaku CD3
Písačková, Jana ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Monoklonální protilátka MEM-57 rozpoznává antigen CD3, exprimovaný na T-lymfocytech periferní krve. Komplex membránových glykoproteinů CD3 asociuje s receptorem T-buněk a je zodpovědný za přenos aktivačního signálu. Protilátka MEM-57 má proto výrazný diagnostický a terapeutický potenciál. Mohla by být využita v diagnostice autoimunitních onemocnění, při klasifikaci T-buněčných leukemií nebo jako imunosupresivum při transplantacích. Nejslibnějším terapeutickým využitím protilátky MEM-57 by však byla konstrukce protilátkového fragmentu ve formátu BiTE (z angl. bispecific T-cell engager) pro léčbu rakoviny. Při konstrukci tohoto protilátkového formátu by byl jednořetězcový variabilní fragment protilátky MEM-57 (scFv, z angl. single-chain fragment, variable) spojen v jedné molekule s fragmentem scFv protilátky proti nádorovému antigenu. Tato práce je zaměřena na charakterizaci rekombinantního fragmentu scFv protilátky MEM-57. K heterologní expresi byl použit kmen E. coli BL21 (DE3) a vektor pET22b(+) kódující sekvenci pelB pro akumulaci produktu v periplasmatickém prostoru, vlastní rekombinantní protilátkový fragment scFv MEM-57, epitop c-myc a histidinovou kotvu. Byl vypracován dvoukrokový purifikační protokol zahrnující chelatační a ionexovou chromatografii, který poskytuje dostatečné množství...
|
|
|
Příprava vazebných partnerů 14-3-3 proteinů pro strukturní studie.
Kopecká, Miroslava ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Tyrosinhydroxylasa patří do skupiny hydroxylas aromatických aminokyselin a katalyzuje počáteční krok biosyntézy katecholaminových neuropřenašečů. Tento enzym má homoteramerní strukturu a skládá se ze tří strukturních domén: N-koncové regulační domény, katalytické domény a C-koncové tetramerizační domény. Aktivita tyrosinhydroxylasy je regulována fosforylací a regulací na úrovni exprese. Fosforylace Ser-19 umožňuje navázání proteinu 14-3-3, které ovlivňuje strukturu regulační domény a chrání ji před její defosforylací a degradací. Struktura regulační domény je stále neznámá, proto jsme se rozhodli pro její objasnění pomocí technik nukleární magnetické rezonance. Byl optimalizován expresní a purifikační protokol regulační domény tyrosinhydroxylasy. Protein byl exprimován jako fúzní protein obsahující histidinovou kotvu na N-konci polypetidového řetězce. Purifikace se skládala ze dvou kroků: z niklové chelatační chromatografie a gelové permeační chromatografie. Dynamický rozptyl světla a 1 H-NMR spektroskopie byly využity k ověření monodisperzity proteinu a jeho možného použití pro další experimenty.
|
|
|
Heterologní exprese NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Stráňava, Martin ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
NADPH:cytochrom P450 reduktasa (CPR) je flavoprotein o velikosti 78 kDa, který je spolu s cytochromy P450 součástí monooxygenasového systému vázaného v membráně endoplasmatického retikula. Monooxygenasový systém se účastní metabolizmu široké škály organických látek, včetně léčiv nebo různých polutantů přítomných v životním prostředí (polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy aj.). CPR funguje jako přenašeč redukčních ekvivalentů z NADPH na příslušné cytochromy P450. Pro správnou interakci s cytochromy P450 je důležitá N-terminální hydrofobní doména kotvící protein v membráně. Odstranění této domény, např. trypsinovou proteolýzou, má za následek vznik solubilní CPR (72 kDa) a ztrátu katalytické aktivity vůči cytochromu P450. V průběhu heterologní exprese v bakteriích E. coli je proteolyticky labilní místo CPR (Lys56 - Ile57) cílem působení intracelulárních proteas s trypsinovou aktivitou, což může negativně ovlivnit výtěžky nativního 78 kDa proteinu. Předkládaná diplomová práce popisuje heterologní expresi, purifikaci a charakterizaci dvou forem potkaní CPR. Forma wtCPR představuje protein přirozeně se vyskytující v potkaním organismu (kmen Wistar), zatímco mCPR obsahuje aminokyselinovou substituci (K56Q) v místě proteolytické degradace. Výsledkem zmíněné substituce je proteolyticky...
|
|
|
Příprava expresních vektorů pro expresi helikasy z virů Zika a Dengue
Daňhelová, Kateřina ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Viry Zika a Dengue se vlivem globalizace rozšiřují do všech kontinentů, které leží aspoň částí v tropickém a subtropickém pásu. S jejich rozšířením souvisí i vzestup vážných onemocnění způsobených těmito viry. Řešením tohoto problému mohou být nová léčiva, jež by byla účinná proti těmto infekcím. Jejich cílem zásahu mohou být různé virové proteiny, mezi nimi i virová helikasa, kterou se zabývá tato bakalářská práce. Tématem této práce bylo připravit expresní konstrukty pro produkci rekombinantních helikas virů Zika a Dengue prostřednictvím vhodného bakteriálního kmene Escherichia coli. Byly připraveny varianty odvozené od plasmidu pET-16b s vloženou helikasou virů Zika a Dengue. Následnou purifikací byla získána helikasa viru Zika, která bude dále využita pro výzkumné účely. Klíčová slova: Flavivirus, virus Zika, virus Dengue, helikasa, exprese, purifikace, enzymová aktivita
|
host ::
RSS.